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DNA di rilevamento

Il DNA può essere rilevato mediante la ﬂuorescenza

del bromuro di etidio o legato tramite autoradiograﬁa

di DNA radiomarcato.

Etidio bromuro (0,5 µg/ml) può essere aggiunto al

tampone di corsa per monitorare il progresso cam-

pione perché ﬂuorescenza del colorante sotto una

lampada UV rivela posizione banda. (Per veriﬁcare

i progressi, spegnere l’alimentazione e rimuovere il

coperchio dell’unità di agarosio. In possesso di un

portatile lampada UV vicino al vassoio in esecuzio-

ne. Rimettere il coperchio e accendere di nuovo per

riprendere elettroforesi.)

In alternativa, dopo elettroforesi, il gel macchia in una

soluzione di bromuro di etidio (0,5 µg/ml H

O) per 15

a 60 minuti e quindi visualizzare o fotografare il cam-

pione su un transilluminatore UV.

Per fotografare il gel, o riporlo in esecuzione sulla

superﬁcie del transilluminatore o far scorrere il gel

sulla superﬁcie per l’esposizione massima. (Il vassoio è

in esecuzione trasparente del 95% a 302-nm leggero

e trasparente, il 40% della luce a 254 nm.) Visualizza

il campione di 366 nm di luce UV o ridotta intensità

di 302-nm di luce UV per ridurre photonicking.

Per ridurre la ﬂuorescenza di fondo di bromuro di

etidio legato, il gel può essere decolorato immergendo

per 5 minuti a 0,01 m MgCl

, o per 1 ora in 0,001 M

MgSO

. Decolorazione rende più facile rivelare piccole

quantità (inferiori a 10 ng) di DNA. (Sambrook, sezio-

ne 6.15).

Bibliograﬁa

Ausubel, et al., (eds). Current Protocols in Molecular

Biology. Greene Publishing and Wiley-Interscience.

New York (1993).

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecu-

lar Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Har-

bor Laboratory Press (1989).

Attenzione! Etidio bromuro

è un noto agente mutageno.

Indossare sempre guanti durante

la manipolazione.

Attenzione! Indossare occhiali di

protezione UV e proteggono la

pelle quando si utilizza qualsiasi

fonte di luce UV.

Nota: il bromuro di etidio

rallenta la migrazione del DNA

di circa il 15%.

Nota: minimizzare il tempo

di colorazione per evitare che

piccoli frammenti di acido

nucleico da diffondendo al di

fuori del gel.

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